擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性AFLP是一種基于PCR技術(shù)的DNA指紋圖譜分析方法，主要用于檢測(cè)基因組DNA的多態(tài)性差異。其核心步驟包括限制性酶切、接頭連接、選擇性擴(kuò)增和電泳分析。
1、酶切與連接：
基因組DNA經(jīng)兩種限制性內(nèi)切酶通常為EcoRI和MseI消化后，產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的片段。酶切產(chǎn)物兩端連接特定接頭序列，為后續(xù)PCR擴(kuò)增提供引物結(jié)合位點(diǎn)。
2、預(yù)擴(kuò)增階段：
使用與接頭序列匹配但末端含1個(gè)選擇性堿基的引物進(jìn)行首輪PCR擴(kuò)增，顯著降低片段復(fù)雜度。該步驟可提高后續(xù)選擇性擴(kuò)增的特異性。
3、選擇性擴(kuò)增：
采用末端含2-3個(gè)選擇性堿基的引物進(jìn)行第二輪PCR，僅擴(kuò)增部分匹配片段。選擇性堿基數(shù)量決定擴(kuò)增條帶數(shù)量，通常產(chǎn)生50-100條可檢測(cè)條帶。
4、電泳檢測(cè)：
擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，通過銀染或熒光標(biāo)記顯示多態(tài)性條帶。不同個(gè)體因基因組差異會(huì)呈現(xiàn)獨(dú)特的條帶分布模式。
5、數(shù)據(jù)解析：
通過比對(duì)電泳圖譜中條帶的有無及遷移率差異，可計(jì)算遺傳相似性系數(shù)。該方法分辨率可達(dá)單個(gè)核苷酸差異，適用于群體遺傳學(xué)和品種鑒定研究。
該技術(shù)操作時(shí)需注意DNA提取質(zhì)量直接影響酶切效率，建議采用CTAB法或商業(yè)化試劑盒獲取高純度DNA。實(shí)驗(yàn)環(huán)境需保持潔凈以避免外源DNA污染，所有耗材應(yīng)經(jīng)高壓滅菌處理。數(shù)據(jù)分析階段建議使用專業(yè)軟件如GeneMarker進(jìn)行條帶判讀，設(shè)置內(nèi)參樣本確保不同批次結(jié)果可比性。對(duì)于臨床樣本檢測(cè)，需建立標(biāo)準(zhǔn)化操作流程并通過盲法驗(yàn)證重復(fù)性。
